1) Expérience de notre TPE

 

 Lors de nos recherches, nous avons qu'une exéprience portant sur la bioluminescence était réalisable. Malheuresement nous ne pouvions la réaliser nous même car cette experience necessitait le maniment de produits toxique tels que L'arsenic. Nous allons malgès tout vous presentez l'experience.

Chez SIGMA (par exemple) il est possible de se procurer des kits de démonstrations, car il est très dur de ce propcurer des lucioles. Ces kits contiennent l'ensembles des produits necessaire à  la réaction. 

Expérience: Prélevez l'abdomen d'animaux congelé, puis broyer le avec de l'eau et un peu de sable dans un mortier, plongez la pièce dans l'obscurité pour pouvoir observé le phénomène de bioluminescence. Si vous n'observer rien il suffit de rajouter 1 mL d'une solution d'ATP à 1mG/mL pour declencher la bioluminescence

Le kit, composé de  flacon contenant le substrat(luciférine) et l'enzyme ( Luciférase) qui son extrait sec de  mg de lanterne de luciole par flacon.Il y a deplus un tampon d'arsenic ( ce qui permet de pouvoir observer le phénomènes plus de 3 minutes) et 15 flacons contenant 1mg d'ATP et 40mg de MgSO4 (sulfate de magnésium).

Dans le flacon contenant Luciférine+luciférase il faut ajouter 5ml d'eau distillé, puis agiter légérement pour dissoudre la poudre.Puis prélevez avec une pipette à poire 1.5 mL* - Plongez la salle dans l'obscurité la plus profonde possible et attendre que la vision s'adapte (pour obtenir de meilleur resultats)- et verser le contenue de la pipette dans le tube contenant de l'ATP : instantanément, on peu observer l'apparition d'une lumière verte qui perdure quelques minutes. 

*IL EST IMPORTANT DE NE JAMAIS PORTER LA PIPETTE A LA BOUCHE ET DE PRENDRE SES PRECAUTIONS ! PRESENCE D'ARSENIC !!

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Cette expérience ne pouvant être réaliser par nos soins, nous nous sommes tourner vers une experience abordable mais plus en rapport avec la fluorescence(qui se rapproche néanmoins de la bioluminescence et de notre TPE) . 

Nous avons nous avons nous même fait une expérience ayant pour but d'illustrer les utilités de la bioluminescence pour les activités humaines. Nous avons donc transformé des bactéries E.Coli en bactéries bioluminescentes grâce à une protéine extrait d'une méduse, la GFP (Green Fluorecent Protein, une protéine qui produit une lumière verte).

Dans un premier temps il nous faut travailler dans une environnement stériel:

1) lavez vous les mains avec du savon, puis avec un peu d'alcool

2) lavez la paillasse avec un papier essuie-tout imbibé d'eau de javel

3) placez un chauffage au milieu de la paillasse et allumez-le à la puissance maximale

 

Puis nous devons ensuite pratiquer une trnagenèse, qui a pour principe de prendre le gène d'une espece donneuse pour l'introduire dans l'organisme d'une espèce receveuse. Comme une nouvelle protéine et introduite dans le corps de la dernière espèce, elle produira donc de nouveaux caractère physique. Durant cette manipulation restez bien dans la zone stéreile.

 

 

4) marquez les microtubes contenant les bactéries, l'un sera le tube "témoin" et l'autre le tube "test"

5) centrifugez ces microtubes à 3500 tours/minutes pendant 3 à 4 minutes

6) eliminezle surnageant dans un bécher 

 

7) ajouter dans le tube "test" 200µL de CaCl2 et 10µL du matériel génétique à transférer

8) ajouter dans le tube "témoin" 200µL de CaCl2 et 10µL d'eau stérile 

9) disposer ces microtubes dans de la glace pendant 10 minutes

10) placez les au bain-marie à 42°C pendant précisément 90 secondes

 

11) replacer-les dans la glace pendant 10 minutes  

 

Maintenant il faut faire la mise en place des bactéries dans des boîtes de pétri.

12) dans les tubes "test" et "temoin" ajoutez 200µL  de milieu nutritifd

13) ensemencez les 2 boîtes de pétri avec des bactérie du tube "test" : 

* déposez 100µL de bactérie dans une boîte traitée aux antibiotiques "Amp+"

* déposez 100µL de bactérie dans une boîte non traitée aux antibiotiques "Amp-"

* marquez sur chaque boîte "test"

* etaler les bactéries dans les boîte en faisant rouler les billes de verre : agiter

* eliminer les billes de la boîte 

14) ensemencez 2 boîtes de pétri avec les bactéries du tube "temoin":

* deposez 100µL de bactérie dans une boîte traitée aux antibiotiques "Amp+"

* deposez 100µL de bactérie dans une boîte non traitée aux antibiotiques "Amp-"

* marquez sur chaque boîte "test"

* etaler les bactéries dans les boîtes en faisont rouler les billes de verre: agiter    

* eliminer les billes de  la boîte

15) emballer dans du papier cellophane, couvercle vers le bas, les 4 boîtes en même temps : "test/Amp+"  "test/Amp-"  "temoin/Amp+"  "temoin/Amp-"

16) incuber 48h à température ambiante

 

Au bout de 48h nous avons put observer que les bactéries étaient "brillante" sous une lumière U.V. Nous avons aussi put consatater qu'en plus de leur capacitée à émettre une lumière elles étaient résistante au médicament ampliciline.

 

 

 

Merci à madame Gasnier de nous avoir permit de faire ce TP.

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